August 19,2017

‘유전자 가위’ 새 버전으로 난치병 치료

CRISPR-Cas9 재가공해 타겟 RNA 추적, 절단

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제3세대 ‘유전자 가위’인 크리스퍼-캐스9(CRISPR-Cas9)의 기능을 가공한 새 버전이 발표됐다.

미국 캘리포니아 샌디에이고 의대 과학자들은 생명과학저널 ‘셀’(Cell) 10일자에 발표한 새로운 연구에서 RNA 추적기술을 보완한 새 유전자 가위 기술로 근긴장성 이영양증 유형1, 2와 가장 일반적인 형태의 유전성 루게릭병 및 헌팅턴병 등을 포함한 ‘미소부수체 반복 확장 질환(microsatellite repeat expansion diseases)’을 유발하는 분자적 오류를 교정했다고 밝혔다.

크리스퍼-캐스9은 최근까지 유전자 본체인 DNA 조작에만 사용될 수 있었으나, UC샌디에이고 의대팀이 2016년 이 기술을 살아있는 세포에서 RNA를 추적할 수 있는 ’RNA-targeting Cas9(RCas9)’이라 불리는 방법으로 용도를 바꿨다.

근긴장성 이영양증 유형1 환자의 근육세포 사진. 왼쪽은 치료되지 않은 세포, 오른쪽은 RNA-targeting cas9 ‘유전자 가위’ 시스템으로 치료한 사진. MBNL1 단백질은 초록색, 반복적 RNA는 붉은 색, 세포핵은 파란색으로 표시됐다. MBNL1은 중요한 RNA 결합 단백질로 반복적 RNA와 결합하면 정상 기능이 파괴된다. 오른쪽의 치료된 세포에서 MBNL1이 반복적 RNA에서 풀려나 있다. Credit: UC San Diego Health

근긴장성 이영양증 유형1 환자의 근육세포 사진. 왼쪽은 치료되지 않은 세포, 오른쪽은 RNA-targeting cas9 ‘유전자 가위’ 시스템으로 치료한 사진. MBNL1 단백질은 초록색, 반복적 RNA는 붉은 색, 세포핵은 파란색으로 표시됐다. MBNL1은 중요한 RNA 결합 단백질로 반복적 RNA와 결합하면 정상 기능이 파괴된다. 오른쪽의 치료된 세포에서 MBNL1이 반복적 RNA에서 풀려나 있다. Credit: UC San Diego Health

치료법 없는 질병에 적용

논문의 시니어 저자인 세포 및 분자 의학과 진여(Gene Yeo) 교수는 “우리는 현재 진행을 지연시킬 방법이 없는 질병의 근본 원인을 목표로 하면서, 바이러스 운반체를 통해 특정 조직에 크리스퍼-캐스9 시스템을 전달할 수 있도록 이를 재가공했다”고 말했다.

DNA는 건축가가 세포를 만들기 위한 청사진과 같다면 RNA는 엔지니어가 이 청사진을 해석하는 것과 같다. 생명과학 정립 이론에 따르면 핵에서 DNA로 암호화된 유전자는 RNA로 전사되고, RNA는 메시지를 세포질로 운반해 여기에서 단백질을 만들기 위해 번역된다.

미소부수체 반복 확장 질환은 세포에 독이 되는 RNA 서열의 잘못된 반복과 함께 부분적으로 이러한 반복이 핵심적인 단백질 생성을 가로막기 때문에 발생한다. 이러한 반복적인 RNA는 세포의 핵이나 세포질에 축적돼 ‘초점(foci)’으로 불리는 조밀한 매듭을 형성하게 된다.

이번의 개념 입증 연구에서 여교수팀은 RCas9을 사용해 환자 유래 세포 및 실험실 질병 세포모델에서 미소부수체 반복 확장 질환과 연관돼 문제를 일으키는 RNA들을 제거했다.

세포질에서 베타-액틴 mRNA 분포를 나타내는 ‘RNA 표적 Cas9’ 시스템을 지닌 세포(2016년 3월 17일자 ‘Cell’지에 RCas9 관련 논문 게재).   Credit: UC San Diego Health Newsroom

세포질에서 베타-액틴 mRNA 분포를 나타내는 ‘RNA 표적 Cas9’ 시스템을 지닌 세포(2016년 3월 17일자 ‘Cell’지에 RCas9 관련 논문 게재). Credit: UC San Diego Health Newsroom

Cas9 효소가 DNA 대신 RNA 겨냥하도록 유도

일반적으로 크리스퍼-캐스9은 다음과 같이 작동한다. 먼저 연구원들이 특정 목표 유전자의 염기서열과 일치하는 ‘가이드(guide)’ RNA를 디자인한다. 가이드 RNA는 Cas9 효소를 유전체의 원하는 지점으로 이끌어 목표로 하는 DNA를 절단한다. DNA가 절단되면 세포가 이를 수선하게 되는데 원래대로 정확한 수선이 이루어지지 않아 유전자가 비활성화되거나, 연구자가 절단 인접 부위를 교정된 유전자로 대체하게 된다. RCas9도 이와 유사하게 작동하지만 가이드 RNA가 Cas9 효소를 DNA 대신 RNA 분자를 겨냥하도록 유도한다.

연구진은 실험실에서 미소부수체 반복 확장 질환에 대해 새로운 RCas9의 기능을 테스트했다. 그 결과 RCas9는 근긴장성 이영양증 유형1, 2와 각각 한 유형의 루게릭병(근위축성측색경화증) 및 헌팅턴병과 연계된 RNA 매듭(foci)의 95% 이상을 제거했다. 이 방법은 또 실험실에서 배양한 근긴장성 이영양증 환자 세포에서 일탈된 반복 RNA의 95%를 제거하는 결과를 나타냈다.

CRISPR Cas9에 의한 형질 감염 및 DNA 절단 개요. crRNA 및 tracrRNA는 플라스미드를 설계할 때 종종 RNA의 한 가닥으로 합쳐진다.  Credit: Wikimedia Commons / Nielsrca

CRISPR Cas9에 의한 형질 감염 및 DNA 절단 개요. crRNA 및 tracrRNA는 플라스미드를 설계할 때 종종 RNA의 한 가닥으로 합쳐진다. Credit: Wikimedia Commons / Nielsrca

RCas9으로 일탈 RNA 93% 반전시켜

또다른 성공적인 결과는 통상 RNA와 결합하는 MBNL1 단백질에서 찾아볼 수 있다. 이 단백질은 근긴장성 이영양증 유형1에서 RNA foci에 의해 수백 개의 자연적인 RNA 표적으로부터 격리돼 있다. 연구진이 여기에 RCas9을 적용하자 기능장애가 있는 RNA의 93%가 반전됐고, 세포들은 건강한 대조 세포군과 유사하게 바뀌었다.

이번 연구는 이 접근법이 실험실에서 성공적으로 작동한다는 증거를 보여주었으나 여교수는 RCas9을 환자에게 직접 테스트하려면 좀더 시일이 걸릴 것이라고 설명했다.

한 가지 걸림돌은 RCas9을 환자 세포에 어떻게 효율적으로 전달하느냐는 것이다. 일반적으로 유전자 요법에 비전염성 아데노 계열 바이러스들이 활용되지만 Cas9을 표적 DNA로 운반하기에는 너무 작다. 여교수팀은 고심 끝에 단백질 영역을 삭제한 작은 버전의 Cas9을 만들었다. 이 단백질 영역은 DNA 절단에는 필요하지만 RNA 결합에는 필요치 않은 부분이다.

여교수는 “우리는 RCas9을 세포에 전달하는 바이러스성 운반체가 면역반응을 유발할지의 여부를 아직 모른다”며, “인체 시험에 앞서 이를 동물모델에서 시험해 잠재적인 독성을 확인하고 장기적인 노출을 평가할 필요가 있다”고 말했다.

연구를 수행한 UC샌디에고의대 진 여 교수(왼쪽)와 데이비드 넬리스 박사(가운데), 란잔 바트라 박사.   Credit: Yeo Lab / UCSD

연구를 수행한 UC샌디에고 의대 여진 교수(왼쪽)와 데이비드 넬리스 박사(가운데), 란잔 바트라 박사. Credit: Yeo Lab / UCSD

임상 활용 위해 벤처기업 세워

여교수팀은 RCas9을 미소부수체 반복 확장에서 나타나는 질병과 같은 RNA 기반 질환을 치료할 수 있는 전임상단계를 관리하기 위해 로카나(Locana)라는 회사를 출범시켰다.

논문 공저자로 여교수 랩의 박사후 과정 연구원인 데이비드 넬리스(David Nelles)박사는 “우리는 크리스퍼-캐스9의 새로운 잠재적 치료 메커니즘을 확인했을 뿐만 아니라 성공적인 치료법이 없는 모든 종류의 질병에 이를 어떻게 활용할 수 있는지를 증명했기 때문에 이 연구에 대해 매우 흥분해 있다”고 말했다.

또다른 논문 공저자인 란잔 바트라(Ranjan Batra) 박사는 “유전체의 다른 장소에 미소부수체 반복 확장으로 인한 유전 질환이 20여개가 더 있다”며, “다른 ‘반복’ 문제를 겨냥해 RCas9 시스템을 프로그래밍할 수 있는 능력이 타겟을 벗어나도 위험도가 낮다는 점과 함께 우리의 큰 힘”이라고 강조했다.

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